目的 建立永生化人肝细胞系（IHCL），评价其作为制备生物人工肝细胞材料的可行性。 方法 利用基因转移技术对原代培养的人肝细胞转染永生化基因猴病毒 40 大 T 抗原和人端粒酶逆转录酶，建立 IHCL。以噻唑蓝法测定 IHCL 细胞生长曲线；流式细胞仪分析细胞增殖周期；裸鼠皮肤和肝脏局部接种观察细胞致瘤性；RT-PCR 检测肝细胞相关基因 mRNA 表达；蛋白质印迹法检测肝功能相关蛋白的表达。应用 Cytodex 3 微载体培养 IHCL，分析细胞的生长状态和细胞密度。将 IHCL 细胞分别与 5 例重症肝功能衰竭患者的血清共培养，培养前后检测血清中胆红素和尿素氮水平，评价 IHCL 的解毒功能。 结果 所建立的 IHCL 具有原代肝细胞的形态，并具有较好的增殖能力，细胞已经传代超过 80 次。IHCL 细胞以 DNA 二倍体整数倍方式增殖，细胞倍增周期为 38 h。裸鼠接种 IHCL 部位均未见肿瘤生长。RT-PCR 检测显示 IHCL 细胞表达 α1-抗胰蛋白酶、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶、谷胺酰胺合成酶和谷胱甘肽硫转移酶的 mRNA；蛋白质印迹分析证实 IHCL 细胞表达这 4 种蛋白。IHCL 细胞可以在微载体上贴附生长，细胞密度可以达到 2.86 × 106 个/ml。将 IHCL 细胞与重症肝功能衰竭患者血清共培养 12、24 和 48 h 后，血清中总胆红素由（346 ± 94）μmol/L 分别下降至（330 ± 97）、（315 ± 97）和（295 ± 100）μmol/L，直接胆红素由（243 ± 70）μmol/L 下降至（218 ± 76）、（198 ± 79）和（184 ± 75）μmol/L，24、48 h 与共培养前比较差异均有统计学意义（P < 0.05）；而尿素氮进行性地升高，由（6.6 ± 0.9）μmol/L 分别升高至（9.0 ± 0.9）、（9.9 ± 1.1）和（12.5 ± 1.6）μmol/L，3 个时间点与共培养前比较差异均有统计学意义（P < 0.01）。 结论 所建立的 IHCL 细胞系具有正常人肝细胞的基本生物学特性和主要的功能特性，具备成为生物人工肝细胞材料的可行性。
目的 探讨噬菌体展示随机肽库技术在结核分枝杆菌培养滤过蛋白 10（CFP-10）/早期分泌抗原靶点 6（ESAT-6）融合蛋白（CE 融合蛋白）模拟抗原表位筛选中的应用。 方法 以抗 CE 融合蛋白多克隆抗体为靶分子，对随机噬菌体 7 肽库进行筛选，经 3 轮生物淘选后，随机选取 18 个单噬菌体进行测序分析。采用双抗体夹心和竞争 ELISA 方法对测序后噬菌体进行阳性克隆及其活性鉴定。采用间接 ELISA 方法，选取阳性单噬菌体与 CE 融合蛋白分别对20 份活动性肺结核患者和 10 份有卡介苗接种史健康人的血清标本抗体进行检测。 结果 经过 3 轮生物淘选，能与靶分子特异性结合的噬菌体得到了明显富集。18 个单噬菌体测序共获得 9 种序列，其中单噬菌体 5、6、18 的氨基酸序列均包含 Trp-Asp-Ala- Thr（WDAT）保守序列，该序列与 ESAT-6 第 58 ~ 61 位氨基酸的序列一致。9 种序列中各取 1 个单噬菌体经双抗体夹心和竞争 ELISA 检测，有 7 个单噬菌体（1、5、6、10、13、14、18，S/N 值依次为 9.2、9.7、9.4、8.9、9.6、9.9、9.0）确定为具有免疫活性的阳性克隆。选取含有 WDAT 保守序列的阳性单噬菌体 5 与 CE 融合蛋白分别对 2 种血清标本抗体进行间接 ELISA 检测结果显示，单噬菌体 5 对 2 种血清标本抗体检测的吸光度值均高于 CE 融合蛋白（分别为 0.931 ± 0.298 vs. 0.317 ± 0.157、0.496 ± 0.073 vs. 0.118 ± 0.026，均 P < 0.05）；单噬菌体 5 对活动性肺结核患者血清标本抗体的检出率（95%，19/20）明显高于 CE 融合蛋白（60%，12/20），而对有卡介苗接种史健康人血清标本抗体的检出率（9/10）低于 CE 融合蛋白（10/10）。 结论 利用噬菌体展示随机肽库技术成功筛选出 7 个 CE 融合蛋白的模拟抗原表位，并获得了定位于 ESAT-6 第 58 ~ 61 位氨基酸序列的 CE 融合蛋白的 1 个线性 B 细胞抗原表位，提高了 ELISA 检测的敏感性，为进一步研究 CE 融合蛋白的其他抗原表位及以特异性抗原表位为基础开发结核抗体检测试剂奠定了基础。
目的 研究缺氧对体外培养成骨细胞血管内皮生长因子（VEGF）和骨形态发生蛋白 2（BMP-2）表达的影响及 意义。 方法 采用酶消化法获取人成骨细胞并进行原代培养，倒置显微镜下观察成骨细胞的生长形态；采用 Gomori 改良钙钴法和免疫组织化学 SABC 法分别检测原代培养成骨细胞碱性磷酸酶（ALP）和骨钙素（OCN）的表达，进行原代培养成骨细胞鉴定。细胞传至第 2 代时，按继续培养条件的不同将细胞分为缺氧组（氧分压 < 4.8 kPa、氧容积比 < 5%）和常氧组，在传代培养 24、48、72 h 时分别收集 2 组细胞，采用免疫组织化学 SABC 法检测 VEGF 和 BMP-2 的表达，应用图像分析系统进行半定量检测，结果以平均灰度值表示，平均灰度值低示表达水平高。 结果 原代培养成骨细胞可表达 ALP 和 OCN，初步确定经体外培养获得了具有生物活性的成骨细胞。在培养 24、48、72 h 时，缺氧组成骨细胞 VEGF 表达水平均明显高于常氧组（平均灰度值分别为 123.53 ± 7.38 vs. 141.21 ± 6.03、116.45 ± 6.34 vs. 138.37 ± 5.04、108.11 ± 5.37 vs. 136.65 ± 6.54，均 P < 0.01），且缺氧组成骨细胞VEGF表达水平随缺氧时间延长而逐渐升高。缺氧组成骨细胞 BMP-2 表达水平在培养 24 h 时明显高于常氧组（平均灰度值为 143.28 ± 2.82 vs. 146.91 ± 2.06，P < 0.01），而在培养 48、72 h 时与常氧组比较，差异均无统计学意义。 结论 缺氧可诱导成骨细胞 VEGF 的表达上调；而缺氧延长则不利于成骨细胞 BMP-2 的表达。缺氧对 VEGF 和 BMP 的早期表达调控可能与骨修复的启动相关。
