目的 量化评价我国人类遗传资源管理政策,探究政策发展规律和现存问题,为后续政策的制定和完善提供参考。
方法 对我国现有的 4 个人类遗传资源管理政策进行文本挖掘,使用词云图展示高频词汇,用社会网络描述高频词间的关联,再结合国外人类遗传资源管理政策构建 PMC 指数模型,包含 10 个一级变量和 49 个二级变量。使用该模型对政策进行量化分析。
结果 我国人类遗传资源管理政策取得了长足进步,最新政策的 PMC 评分已达国际先进水平,总体规划较为合理,但还有需要完善的地方。
结论 我国人类遗传资源管理政策发展迅速,可以满足当前形势下人类遗传政策管理需求。但仍存在部分定义模糊,缺少配套文件,缺少人才培养规范等问题,需要进一步完善政策以充分保护、利用我国人类遗传资源,推动我国和世界卫生健康事业发展。
生物安全二级实验室(BSL-2/ABSL-2 实验室)是开展第三类病原微生物实验活动以及第二类病原微生物的样本检测和未经培养的感染材料操作所必需的生物安全实验室。
2023 年 6 月 29 日,《生物安全二级实验室运行管理通用要求》团体标准在中国医药生物技术协会批准立项。中国医药生物技术协会生物安全专业委员会于 2023 年 10 月 8 日成立标准编制组,正式启动团体标准编制工作。
按照《中华人民共和国生物安全法》和国务院 424 号令《病原微生物实验室管理条例》的要求,病原微生物实验室的设立单位负责实验室的生物安全管理,制订科学、严格的管理制度,定期对有关生物安全规定的落实情况进行检查。《生物安全二级实验室运行管理通用要求》对指导实验室设立单位或机构对生物安全二级实验室的日常运行管理工作制订一套完整的管理程序和措施,更好地保障生物安全二级实验室的标准化运行和管理是非常必要的。
标准编制组通过搜集整理国内外相关行业规范、文献和相关标准,开展系列研究工作,分析相关信息,形成了《生物安全二级实验室运行管理通用要求》的编写内容;标准编制组结合我国国情,确定了以病原微生物安全二级实验室为编制对象,以运行要求为技术导向,以实验室运行管理为编制原则和技术框架。标准编制过程中共收到 12 家单位 60 条修改意见和建议,编制组经过汇总、梳理,采纳意见 55 条,部分采纳 4 条,不采纳意见 1 条。编制组对征求的意见进行了研讨和分析,对《生物安全二级实验室运行管理通用要求》进行修改和补充完善。经过协会标准工作委员会审定、公示等程序,《生物安全二级实验室运行管理通用要求》于 2024 年 7 月 3 日发布并实施。
《生物安全二级实验室运行管理通用要求》是现行有效的法律法规和技术标准与病原微生物实验室活动和管理具体实践的结合,有助于规范生物安全二级实验室运行管理文件的编制和信息统一,提升生物安全二级实验室运行管理的标准化。需要说明的是,本标准是针对人间传染的病原微生物为对象的生物安全二级实验室运行管理的指南。
目的 建立一种可用于测定单抗药物分子大小变异体的分析超速离心法。
方法 通过对转速、温度及数据分析参数等关键指标的优化,得到一种测定单抗药物分子大小变异体的方法,对该方法的专属性、重复性、精密度及线性进行方法学验证。
结果 优化得到的最佳实验条件:转速为 50 000 r/min,温度为20 ℃,分析参数“Resolution”为 150,“s max”为 20。方法学验证结果表明,6 次重复性实验的 RSD 为 0.91%,总体精密度 RSD 为 0.78%,在 0.2 ~ 0.8 mg/mL 的浓度条件下线性良好。
结论 该分析超速离心法的专属性、重复性、精密度和线性良好,可用于单抗药物分子大小变异体的测定。
目的 建立基于逆转录酶活性的复制型慢病毒检测方法,并进行方法学验证及适用性研究。
方法 以莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶为标准品,以噬菌体 MS2 RNA 为模板,经反转录后采用 TaqMan 探针实时荧光定量 PCR 方法检测特异性扩增信号。对方法的专属性、线性范围、准确度、重复性、中间精密度、最低定量限、最低检出限、耐用性和适用性进行验证。
结果 通过优化 qPCR 引物、探针浓度及反应条件,已建立稳定灵敏的逆转录酶活性检测方法。该方法专属性良好,对 4 种类型的细胞上清样品均无特异性扩增;在 104 ~ 109 pU/μL 之间具有良好线性范围,r2 > 0.99,且扩增效率 处于 93% ~ 97%;准确度回收率在 86% ~ 102%,重复性 RSD ≤ 6%;中间精密度良好,加标样品 RSD ≤ 4%;最低定量限为 8000 pU/μL;最低检出限为 100 pU/test;耐用性良好,RSD ≤ 8%,回收率 89% ~ 105%;通过指示细胞培养法接种的三类样品(CAR-T 细胞终产品样品、慢病毒载体生产终末细胞样品、慢病毒载体未加工收获液)及其病毒感染加标样品,在感染终末阶段收样后使用本方法进行逆转录酶活性检测的结果显示,三类样品均未检出复制型慢病毒,而病毒感染加标组样品均可检出病毒,方法适用性良好。
结论 建立了稳定可靠的基于逆转录酶活性的复制型慢病毒检测方法,各项方法学验证结果均达满意要求,且方法适用于指示细胞培养法终末阶段收样的检测,为基因治疗产品临床应用的安全性研究提供技术支撑。
目的 探讨脐带间充质干细胞(UC-MSC)移植治疗高氧导致的新生大鼠肺损伤的疗效及可能的调控机制。
方法 从人脐带中分离间充质干细胞并进行体外培养,流式细胞术鉴定细胞表型;新生大鼠 36 只随机分为 3 组,分别为对照组、模型组和治疗组,除对照组外,其余两组大鼠均置于高压氧箱内饲养,建立肺损伤模型,对照组置于室内空气中饲养,造模 4 d 后,治疗组给予细胞注射,对照组和模型组给予生理盐水注射。2 周后处死新生大鼠,测定各组大鼠肺组织湿/干重比值,组织切片染色观察各组大鼠肺组织病理学情况、血管肌化情况和微血管密度情况;测定各组大鼠肺组织活性氧(ROS)、髓过氧化物酶(MPO)活性和丙二醛(MDA)、IL-6、IL-1β 和 TNF-α 的表达水平。
结果 与对照组新生大鼠相比,模型组新生大鼠肺组织湿/干重比值、ROS 活性、MPO 活性、MDA 含量均增高,炎症因子 IL-6、IL-1β 和 TNF-α 的表达水平均升高,显示造模成功;治疗组与模型组相比,肺组织湿/干重比值、ROS 活性、MPO 活性、MDA 含量均降低,炎症因子 IL-6、IL-1β 和 TNF-α 的表达水平均降低,肺组织水肿和炎性细胞浸润情况明显好于模型组,血管肌化情况显著减轻,微血管密度显著增高。
结论 UC-MSC 能显著改善高氧环境下导致的新生大鼠肺损伤程度,具有一定的修复作用。
目的 探究灯盏细辛注射液(EBI)体内外对肝癌的抗肿瘤作用及线粒体凋亡通路相关机制。
方法 培养人肝癌细胞系 HCCLM3、Huh7 和 HepG2,采用 CCK-8 法检测细胞活力,细胞死活染色实验检测细胞死亡情况;通过 Transwell 迁移实验评估细胞迁移能力;使用 Western blot 检测线粒体凋亡相关蛋白 Bcl-2、Bax 和 caspase-3 的表达变化;构建高转移性的人肝癌细胞 HCCLM3 皮下移植瘤模型,比较皮下移植瘤生长和肝脏转移情况。
结果 CCK-8 实验显示,EBI 以剂量依赖性方式抑制 HCCLM3、Huh7 和 HepG2 细胞增殖,IC50 值分别为 81.41、177.90 和 209.70 μg/mL;细胞死活染色实验结果显示,EBI 促进 HCCLM3 细胞死亡,呈浓度依赖性;Transwell 迁移实验显示,EBI 处理显著降低细胞迁移数量,呈浓度依赖性。Western blot 分析显示,EBI 降低抗凋亡蛋白 Bcl-2 的表达,上调促凋亡蛋白 Bax 的表达,并降低执行切割的 caspase-3 前体蛋白的表达,且调控作用呈浓度依赖性,表明 EBI 激活线粒体凋亡途径。体内实验显示,EBI 显著抑制 HCCLM3 移植瘤的生长及肝脏转移。
结论 EBI 在体内外均能显著抑制肝癌细胞的增殖和转移,其作用机制可能通过激活线粒体凋亡途径实现。
目的 建立一种通过同时测定注射用亚锡替曲膦中磷(P)和锡(Sn)元素含量计算替曲膦和氯化亚锡含量的电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)方法。
方法 通过 2% 硝酸溶解、超声、离心等简单的前处理,使用 ICP-MS 对注射用亚锡替曲膦中两种元素进行测定。ICP-MS 的采集模式选择动能歧视(KED)模式,P 的测定以钒为内标,Sn 的测定以锑为内标,重复采样三次取平均值。
结果 方法学验证显示,P 和 Sn 在 0 ~ 10 μg/mL 浓度之间与其相对应的计数值呈现良好的线性关系,相关系数(r)分别为 1.000 和 0.9999,P 的定量限和检测限分别为 3.073 × 10-2 μg/mL 和 1.014 × 10-2 μg/mL,Sn 的定量限和检测限分别为 9.850 × 10-4 μg/mL 和 3.251 × 10-4 μg/mL,P 和 Sn 元素的加标回收率分别为 101.0% 和 100.3%,RSD 分别为 5.35%(n = 9)和 4.68%(n = 9)。
结论 ICP-MS 法简便、快速,能够较好满足注射用亚锡替曲膦中氯化亚锡和替曲膦含量测定的要求。
目的 研究不同试验体系中组氨酸含量对鼠伤寒沙门氏菌回复突变菌落数背景值的影响。
方法 选择药品和食品安全性评价中常用的鼠伤寒沙门氏菌 TA97a、TA98、TA100、TA1535 和 TA1537,分别在非代谢活化和代谢活化条件下开展基于 6 孔板(mini-Ames 试验,组氨酸浓度范围为 0.03 ~ 1 mg/mL)和标准平皿 Ames 试验(组氨酸浓度范围为 0.01 ~ 0.5 mg/mL)。
结果 Mini-Ames 试验中组氨酸浓度在 0.2 ~ 0.3 mg/mL 范围内时,TA98、TA100 和 TA1535 在无或有 S9 条件下的回复菌落数与溶媒对照组相比增加 2 倍或 3 倍以上,呈阳性结果。标准平皿 Ames 试验中无或有 S9 条件下所有菌株结果均为阴性。此外,无或有 S9 时,组氨酸浓度在 0.5 mg/mL 及以上时菌株菌落数减少且使背景菌苔增厚。
结论 与标准平皿 Ames 试验相比,mini-Ames 试验易于出现阳性结果。组氨酸浓度范围在 0.2 ~ 0.3 mg/mL 时可影响细菌回复突变试验背景值,且高浓度组氨酸对菌株存在明显细菌毒性。因此有必要测定受试物中组氨酸含量或增加适宜的对照组,保证研究结果准确性。
目的 建立自然杀伤细胞(NK 细胞)体外杀伤活性检测方法并进行验证。
方法 以慢性髓源白血病细胞 K562 为靶细胞,使用 5(6)-羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯(CFDA SE)标记后,将携带 CFSE 荧光的靶细胞按照不同的效靶比与 NK 细胞共培养。使用死细胞染料碘化丙啶(PI)与早期凋亡染料 Annexin V 对共培养的细胞进行染色后,采用流式细胞仪对 CFSE 荧光筛对靶细胞圈门,同步圈门 PI 检测其死亡率与 Annexin V 检测早期凋亡率,计算杀伤率。对活细胞染料 CFDA SE 与死细胞染料 PI 及早期凋亡染料 Annexin V 使用量、检测限与定量限、准确度、重复性、再现性进行验证。
结果 经过活细胞染料 CFDA SE 用量验证后,2 × 106 个K562 靶细胞的 CFDA SE 最佳使用量为 0.2 μL。PI 与 Annexin V 的最佳使用量均为 1 μL/Test。靶细胞死亡与早期凋亡检出限为 0.1%,定量限为 0.5%。准确度、重复性、再现性验证结果均能满足 YY/T 0588《流式细胞仪》中表面标志物检测的重复性 a) 阳性百分比 ≥ 30% 时,CV 值应 ≤ 8%;或 b) 阳性百分比 < 30% 时,CV 值应 ≤ 15% 的要求。t 值与理论值符合 95% 置信水平中的统计学要求。
结论 建立的 NK 细胞体外杀伤活性检测方法符合标准化评价体系,为 NK 细胞功能检测与质量评价提供了参考依据。